為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣,可應(yīng)用如下的試驗:用其他免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本,將它們進行一系列稀釋后,在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操縱步驟進行測定,然后比較結(jié)果。ELISA試劑盒可作ELISA中載體的材料良多,zui常用的是聚苯乙烯。在ELISA試劑盒中用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠,表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果差別zui大,這種載體就是這一ELISA測定項目的zui合適的固相載體。小珠的另一特點是更易于使洗滌*,使用特殊的洗滌器,使小珠在洗滌過程中動彈淋洗,其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。常用的檢查方法為:以一定濃度的人IgG(一般為10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體,保溫后洗滌,加底物顯色,終止酶反應(yīng)后,分別測每孔溶液的吸光度。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,反應(yīng)后用磁鐵的吸引進行分離,洗滌利便,試劑盒一般均配以特殊儀器。與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差,應(yīng)小于10%。其長處是表面積極大,反應(yīng)在懸液中進行,其速率與液相反應(yīng)近似。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附機能好,空缺值低。
ELISA載體的外形主要有三種:微量滴定板、小珠和小試管。固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器,不介入化學(xué)反應(yīng)。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為100-200ul,而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積,標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試驗敏感性的進步?,F(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測,包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟,對操縱的尺度化極為有利。為便于作少量標(biāo)本的檢測,有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的,放入座架后,ELISA試劑盒大小與尺度ELISA板相同。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后,其吸附機能特別是對免疫球蛋白的吸附機能增加,應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多,但用于間接法測抗體時空缺值較大。也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA試劑盒固相載體的。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附機能比聚苯乙烯高,但空缺值也略高。聚苯乙烯ELISA板因為原料的不同和制作工藝的差別,各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,因此,每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其機能。
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