1.如何選用培養(yǎng)基?
培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之,MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng),各種目的無血清培養(yǎng)的是AIM V培養(yǎng)基(SFM)。在開始進行新的細胞培養(yǎng)時,可以參考下表所列的條件:
細胞系 細胞類型 種 組織 推薦使用的培養(yǎng)基
293 成纖維細胞 人 胚胎腎 MEM, 10% 熱滅活馬血清
3T6 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
A549 上皮細胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清
A431 上皮型 人 表皮細胞癌 DMEM, 10% 胎牛血清
A9 成纖維細胞 小鼠 結(jié)締組織 DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20 上皮細胞 小鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3 成纖維細胞 小鼠 胚胎 DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21 成纖維細胞 倉鼠 腎 GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
BHL-100 上皮細胞 人 乳房 McCoy', 10% 胎牛血清
BeWo 上皮滋養(yǎng)層 人 絨毛癌 F-12K, 15%胎牛血清
BT 成纖維細胞 牛 鼻甲骨細胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA
Caco-2 上皮細胞 人 結(jié)腸腺癌 MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA
Chang 上皮細胞 人 肝臟 BME, 10% 小牛血清
CHO-K1 上皮細胞 倉鼠 卵巢 F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9 上皮細胞 大鼠 肝臟 F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3 上皮細胞 小鼠 黑素瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7 成纖維細胞 猴 腎 DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK 上皮細胞 貓 腎 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
CV-1 成纖維細胞 猴 腎 MEM, 10% 胎牛血清
D-17 上皮細胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Daudi 成淋巴細胞 人 淋巴瘤病人血液 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% , 胎牛血清
GH3 上皮細胞 大鼠 垂體腫瘤 F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
H9 成淋巴細胞 人 T細胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK 上皮細胞 倉鼠 腎 BME, 10% 小牛血清
HCT-15 上皮細胞 人 結(jié)腸直腸腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa 上皮細胞 人 子宮頸癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2 上皮細胞 人 喉 癌 MEM, 10% 胎牛血清
HL-60 成淋巴細胞 人 早幼粒細胞白血病 RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080 上皮細胞 人 纖維肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA
HT-29 上皮細胞 人 結(jié)腸腺癌 McCoy's , 10% 胎牛血清
HUVEC 內(nèi)皮細胞 人 臍帶 F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素鹽 100 ug/ ml
I-10 上皮細胞 小鼠 睪丸癌 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9 成淋巴細胞 人 骨髓瘤病人骨髓 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2 上皮細胞 人 絨毛膜癌 MEM, 10% 胎牛血清
Jensen 成纖維細胞 大鼠 肉瘤 McCoy's , 5% 胎牛血清
Jurkat 成淋巴細胞 人 淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562 成淋巴細胞 人 骨髓性的白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB 上皮細胞 人 口腔癌 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
KG-1 骨髓白細胞 人 紅白血病病人骨髓 IMDM, 20% 胎牛血清
L2 上皮細胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清
L6 大鼠 骨骼肌成肌細胞 DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256 上皮細胞 大鼠 癌 Medium 199, 5% 馬血清
McCoy 成纖維細胞 小鼠 未知 MEM, 10% 胎牛血清
MCF7 上皮細胞 人 乳腺癌 MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰島素
WEHI-3b 類巨噬細胞 小鼠 骨髓單核細胞白血病 DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38 上皮細胞 人 胚胎肺 BME, 10% 胎牛血清
WISH 上皮細胞 人 羊膜 BME, 10% 胎牛血清
WS1 人 胚胎皮膚 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
XC 上皮細胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA
Y-1 上皮細胞 小鼠 腎上腺瘤 F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
2.為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。
3.L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?
L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有zui終確定。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。
4.GlutaMAX-I是什么?培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩(wěn)定?
GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,將其不穩(wěn)定的α-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I二肽溶液有zui小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解。
5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
6.如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞?
用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200-2000個/毫升,在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數(shù)分鐘后,用血球計數(shù)板計數(shù)細胞?;罴毎懦馀_盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。
7.如何消除組織培養(yǎng)的污染?
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。
1.在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞,稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。
2.分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3.每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。
4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2-3代。
5.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。
6.重復(fù)步驟4。
7.在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代,確定污染是否以已被消除。
8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?
丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
9.為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?
GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化,儲存在2-8℃時,血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在-20℃儲存胎牛血清,避免反復(fù)凍融。
10.目錄上說,Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?
Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。
11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標準檢驗程序,而且除了這些標準檢測,Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測:
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗
生物化學(xué)檢測
激素的檢測
血紅蛋白檢測
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